La nucleofosmina (NPM1) è una proteina nucleolare coinvolta nella sintesi dei ribosomi, nella duplicazione dei centrosomi, nel controllo del ciclo cellulare e nelle risposte a stimoli da stress. Per eseguire queste molteplici funzioni, NPM1 si muove fra nucleo e citoplasma, sebbene la gran parte della proteina sia localizzata nei nucleoli. Nel 2005, il gene NPM1 è stato identificato come quello mutato più frequentemente nella leucemia acuta mieloide (30% dei casi): le mutazioni riguardano l’esone terminale del gene e sono sempre etorozigoti. Sono state identificate circa 50 mutazioni ma l’effetto a livello proteico è simile in tutti i casi. Il quadro di lettura viene alterato, in seguito alla duplicazione o inserzione di piccole sequenze di basi, generando una proteina che ha perso il segnale di localizzazione nucleare, ha acquisito un nuovo segnale di esporto nucleare ed è largamente destabilizzata o totalmente denaturata nel suo dominio C-terminale. Queste variazioni causano la traslocazione stabile della proteina nel citoplasma. Inoltre, poichè il dominio N-terminale della proteina oligomerizza con il suo omologo nativo, prodotto dall’allele non mutato, anche la gran parte di NPM1 nativa è traslocata nel citosol e solo una piccola frazione risiede nei nucleoli dei blasti leucemici. Il dominio C-terminale di NPM1 lega gli acidi nucleici. Recentemente i ricercatori coinvolti nel progetto hanno dimostrato che questo dominio lega il DNA ripiegato a G-quadruplex ed hanno analizzato la struttura del complesso con una regione G-quadruplex del promotore del gene c-MYC. Successivamente, in una pubblicazione recente, essi hanno dimostrato l’esistenza di un nesso fra il legame delle regioni G-quadruplex e la localizzazione nucleolare. Infatti NPM1 lega specifiche regioni G-quadruplex sul gene del DNA ribosomiale, sia in vitro che in vivo, e questa interazione è abolita nel mutante leucemico. Inoltre gli stessi ricercatori hanno dimostrato che mutanti di refolding della variante leucemica riacquisiscono la capacità di legare i quadruplex e la localizzazione nucleolare ed infine, come sia possibile dissociare NPM1 nativa dai nucleoli trattando le cellule con un ligando dei quadruplex. I mutanti di NPM1 sono destabilizzati e risiedono stabilmente nel citosol dei blasti leucemici insieme con la gran parte della proteina nativa. Gli effetti causati da questa traslocazione sono molteplici e consistono sia nella perdita di funzioni nucleari che nell’acquisizione di nuove, ed indesiderate, attività citosoliche. Dato che essi sono molto difficili da contrastare individualmente, sono state proposte due diverse strategie entrambe basate sul dominio C-terminale della proteina come bersaglio terapeutico. La prima strategia si propone di trovare un farmaco che agisca sulla frazione nucleolare di NPM1 wild-type, dissociandola dal nucleolo. Dato che NPM1 è necessaria per il mantenimento della struttura nucleolare, tale farmaco potrebbe causare stress nucleolare e apoptosi nel blasto leucemico. Una seconda strategia mira a trovare un chaperone farmacologico, ossia una molecola che, legando il dominio C-terminale mutato, ne alteri l’equilibrio nativo/denaturato verso la forma nativa. Tale farmaco potrebbe promuovere la rilocalizzazione nucleare di NPM1, contrastando gli effetti anti-apoptotici esercitati da NPM1 citosolica.
Il progetto è disegnato per esplorare entrambe queste possibilità ed è diviso in tre TASK specifici:
1. Investigare, attraverso una combinazione di cristallografia ed analisi spettroscopica su mutanti sito-diretti, l’associazione fra il dominio C-terminale di NPM1 e regioni G-quadruplex all’rDNA e promotori di oncogeni e come questo legame sia influenzato da molecole interferenti (che leghino la proteina o le regioni G-quadruplex).
2. Sviluppare una sistema FRET in vitro allo scopo di testare piccole librerie di farmaci per identificare un chaperone farmacologico
3. Valutare l’effetto di farmaci selezionati nell’influenzare i) la stabilità del dominio C-terminale leucemico, ii) la sua capacità di legare le regioni quadruplex all’rDNA e iii) valutare l’effetto di farmaci selezionati su linee cellulari di AML con mutazione di NPM1, e con NPM1 nativo per confronto.
PI di questo progetto è Luca Federici, Professore Associato di Biochimica (SSD: BIO/10) afferente al Dipartimento di Scienze Sperimentali e Cliniche.
Il progetto è disegnato per esplorare entrambe queste possibilità ed è diviso in tre TASK specifici:
1. Investigare, attraverso una combinazione di cristallografia ed analisi spettroscopica su mutanti sito-diretti, l’associazione fra il dominio C-terminale di NPM1 e regioni G-quadruplex all’rDNA e promotori di oncogeni e come questo legame sia influenzato da molecole interferenti (che leghino la proteina o le regioni G-quadruplex).
2. Sviluppare una sistema FRET in vitro allo scopo di testare piccole librerie di farmaci per identificare un chaperone farmacologico
3. Valutare l’effetto di farmaci selezionati nell’influenzare i) la stabilità del dominio C-terminale leucemico, ii) la sua capacità di legare le regioni quadruplex all’rDNA e iii) valutare l’effetto di farmaci selezionati su linee cellulari di AML con mutazione di NPM1, e con NPM1 nativo per confronto.
PI di questo progetto è Luca Federici, Professore Associato di Biochimica (SSD: BIO/10) afferente al Dipartimento di Scienze Sperimentali e Cliniche.